För vanliga petriskålar med glasbotten på marknaden görs vanligtvis ett hål i botten av en petriskål av plast, och sedan limmas ett täckglas eller cellglas med en tjocklek av 170-220 μm på botten av petriskål med skuggfritt lim eller silikagel. Inte hela botten av petriskålen är gjord av glas. Det område som är lämpligt för observation är endast i området för perforeringen. Men på grund av glasets hydrofobicitet, när celler odlas, kan cellerna inte fästa bra till glaset, och tillväxttillståndet är inte bra, och till och med fenomenet med celldelaminering inträffar under konfokal scanningsavbildning.
För att cellerna ska vidhäfta väl är det nödvändigt att bekräfta att specifika proteinreagens har belagts innan man använder glasbottenskålar för cellodling.
gör-det-själv täcke
Olika cellkulturer kräver olika beläggningsreagens. Samtidigt, eftersom proteinet som används för beläggning är en biologisk produkt, är produktrenheten och doseringen av beläggningsproteinet från olika företag olika. Detta tekniska inlägg är endast för referens. Den specifika dosen av beläggningsreagens bör hänvisa till instruktionerna för de märken som används. . Och det är bäst att göra ett gradientexperiment med de reagenser du använder för att hitta den mest lämpliga beläggningskoncentrationen.
Här är ett exempel på poly-L-lysin (PLL, sigma, P4832, 100 ug/ml):
PLL-beläggning är lämplig för de allra flesta celler, särskilt för odling av neuroner i det centrala systemet. Det är nödvändigt att göra proteinhalten (ug/cm2) per ytenhet för att uppnå önskad mängd under användning. Den rekommenderade mängden beläggning för PLL i detta exempel är 2 ug/cm2. Det är nödvändigt att beräkna mängden protein som krävs enligt beläggningsarean och beläggningsvolymen.
Till exempel: 35 mm petriskål med glasbotten, celltillväxtarean är 3,5 cm2, beläggningsarean är 4,1 cm2 och volymen av beläggningslösningen är 400 ul, då är den rekommenderade dosen 2ug/cm2. Då behövs 8,2 ug PLL i en enda brunn. Om endast 400 ul PLL-lösning tillsätts är koncentrationen av PLL-lösning 20,5 ug/ml (cirka 20 ug/ml). Därför måste stamlösningen spädas med ultrarent vatten.
Specifika steg:
1. Späd PLL-stamlösningen 1:5 med ultrarent vatten.
2. Tillsätt 400 ul PLL-spädning till varje 35 mm petriskål med glasbotten.
3. Inkubera i 1-2 timmar vid rumstemperatur och aspirera PLL-spädningen.
4. Tvätta försiktigt 3 gånger med 2 ml PBS-lösning eller serumfritt medium och aspirera tvättlösningen.
5. Tillsätt cellsuspensionen direkt för odling.
Metodutvärdering
På grund av de olika egenskaperna hos olika beläggningsproteiner används olika beläggningsproteiner på olika sätt. Ny förorening skapas ofta på grund av behovet av att belägga skålar med glasbotten. Dessutom upptäcks föroreningar ofta efter att cellerna har höjts, vilket inte bara fördröjer tiden, utan också slöser med förbrukningsvaror från kitet. När allt kommer omkring är belagda proteinreagenser och kvalitetssäkrade glasbottenskålar dyra (glasbottenskålar av dålig kvalitet kan läcka eftersom limmet inte är klibbigt eller att limmet som används är giftigt för celler).
Konfokala petriskålar utan beläggning
För barn som vill spara tid och ansträngning är det bekvämare att använda konfokala kulturrätter utan beläggning.
Faktorer att tänka på när man väljer en lämplig odlingsrätt är: om den är lämplig för dina egna celler att hålla sig till, om de optiska egenskaperna hos odlingsrätten uppfyller de konfokala kraven.
Petriskålar som uppfyller kraven för ovanstående faktorer är inte begränsade till belagda glasbottenskålar. Faktum är att alla vet att plastfat är billigare och lättare för celler att fästa vid än glas. Här är ett exempel på en konfokal kulturrätt från Shanghai Jingan, för att prata om parametrarna som en kulturrätt som är lämplig för konfokala experiment behöver ha:
Det kan ses att de fysiska parametrarna för konfokala odlingsrätter som uppfyller kraven för direkt användning ligger mycket nära glas, men samtidigt har de också hydrofila egenskaper, vilket kan få de flesta celler att fästa bättre; och duktilitet är bättre än glas. Det tillåter de flesta cellinjer och primärceller att fästa direkt på väggen och är inte ömtålig, vilket är ett bra val.
Du kan också hitta den mest lämpliga konfokala odlingsrätten för ditt experiment enligt dina specifika experimentella krav och parametrarna i tabellen ovan.
Metodutvärdering
Att välja denna typ av petriskål kräver inte ytterligare beläggning, vilket avsevärt minskar risken för kontaminering. Och eftersom plastbotten är lättare att arbeta med behövs inget lim för att fästa den i petriskålens botten. Eliminera risken för läckage eller cytotoxicitet.
