1. Cellåtervinning
Efter att de kryokonserverade cellerna avlägsnats från det flytande kvävet, tinades de under konstant skakning i ett 37 graders vattenbad. Överför de tinade cellerna till ett centrifugrör, tillsätt förvärmt DMEM-komplett medium vid 37 grader (varav fetalt bovint serum är cirka 10 procent), blås försiktigt jämnt, centrifugera vid 500 g i 2 minuter och kassera supernatanten.
Tillsätt DMEM komplett medium för att tvätta och kassera supernatanten. Tillsätt DMEM komplett medium, blanda försiktigt genom pipettering, gör en cellsuspension, ympa den i en petriskål/kolv och odla i en cellinkubator som innehåller 5 procent CO2.
2. Cellpassage
När celltätheten når 80 procent ~90 procent (för tidigt utbyte är otillräckligt, för sena celler är i dåligt skick, subkultur i förhållandet 1:2 till 1:10 eller mer, vanligtvis 1:3 till 1:5 cellgenerering, det vill säga från cellympning Vid tidpunkten för separation och återodling avlägsnades det fullständiga mediet och tvättades två gånger med IX PBS.
Tillsätt trypsin (observera: mängden matsmältningslösning är bäst för att täcka cellerna, och den optimala matsmältningstemperaturen är 37 grader . Observera cellerna under ett mikroskop: observera de smälta cellerna under ett inverterat mikroskop, om cytoplasman dras tillbaka, cellerna är inte längre sammankopplade. Skivor, som indikerar att cellerna är ordentligt smälta vid denna tidpunkt), smält dem och placera dem i en cellinkubator i cirka 2-3 minuter.
Tillsätt en lämplig mängd DMEM komplett medium för att stoppa trypsinisering, överför till ett centrifugrör och centrifugera vid 500 g i 2 minuter, kassera supernatanten, tillsätt DMEM komplett medium för att tvätta och kassera supernatanten.
Tillsätt komplett DMEM-medium, blanda genom att försiktigt pipettera, pipettera 10 mikroliter för räkning och fortsätt sedan att odla i en cellinkubator innehållande 5 procent CO2 enligt den cellvolym som krävs.
3. Kryokonservering av celler
När celldensiteten når 80 procent ~ 90 procent, ta bort hela mediet och tvätta 2 gånger med 1X PBS. Tillsätt trypsin för matsmältning och placera i en cellinkubator i cirka 2-3 min. Tillsätt komplett DMEM-medium för att stoppa trypsinuppslutningen, överför till ett centrifugrör och centrifugera vid 500 g i 2 minuter, kassera supernatanten, tillsätt DMEM-komplett medium för att tvätta och kassera supernatanten. Tillsätt 1 ml fryslösning (90 procent fetalt bovint serum, 10 procent DMSO. Generellt sett kan seruminnehållet justeras mellan 10 procent och 90 procent. Att tillsätta serum till fryslösningen kan å ena sidan ge näringsämnen till celler och kan Tillhandahåll icke-permeabla skyddande ämnen under cell kryokonservering, såsom sackaros, albumin, etc. för att bättre skydda cellerna), lägg det i ett kryokonserveringsrör (det finns isopropylalkohol i röret för att säkerställa hastigheten på temperatursänkningen), lägg det omedelbart Frys in i ett 4 graders kylskåp i 30 minuter, placera det sedan i ett -20 graders kylskåp i 30 minuter och ställ det sedan i ett -80 graders kylskåp över natten.
Lägg den i flytande kväve dagen efter, den kan lagras i minst två år, och om du inte lägger den i flytande kväve kan den lagras i tre månader.
Principen för cell kryokonservering och återhämtning är: långsam frysning och upptining, vilket är mer gynnsamt för att upprätthålla cellviabilitet. Kryokonservering av celler utan något skyddande medel kommer att leda till produktion av intracellulära iskristaller, vilket kommer att orsaka endogen mekanisk skada på celler, orsaka förändringar i intracellulär miljös osmotiskt tryck, pH, elektrolyter, etc., och sedan främja celldöd.
4. Saker som kräver uppmärksamhet
(1) Förvärmning av odlingslösningen: placera den förberedda flaskan som innehåller odlingslösningen, PBS och trypsin i ett 37 graders vattenbad för att förvärma;
(2) Använd 75 procent alkohol för att torka av den ultrarena arbetsbänken och händer som har bestrålats med ultravioletta strålar;
(3) Korrekt placering av använda instrument: säkerställ tillräckligt med driftsutrymme, vilket inte bara är lätt att använda utan också minskar föroreningar;
(4) Tänd alkohollampan: observera att lågan inte får vara för liten;
(5) Strikt aseptisk drift;
(6) Måttlig nedbrytning av vidhäftande celler: Uppslutningstiden påverkas av många faktorer såsom typen av uppslutningslösning, beredningstid och mängden som tillsätts till odlingskolven. Under matsmältningsprocessen bör uppmärksamhet ägnas åt förändringarna i formen på de odlade cellerna. När cytoplasman krymper, Om anslutningen lossnar, eller det finns tecken på att flyta i bitar, bör matsmältningen avslutas omedelbart;
(7) Alla operationer på passerade celler bör vara så nära lågan från en alkohollampa som möjligt. Det är bäst att arbeta med endast en cell åt gången, med en uppsättning utrustning för varje cell. undvika korsinfektion;
(8) Flasköppningen på den passade cellen måste steriliseras på en alkohollampa varje gång den öppnas eller stängs.
