PCR-tekniken måste ha artificiellt syntetiserade rimliga primers och extraherat prov-DNA, och sedan utföra automatisk termisk cykling och slutligen utföra produktidentifiering och analys. För närvarande kan primerdesign och syntes endast utföras i ett fåtal forskningsinstitut, institut och kliniker med stark teknisk styrka. Applikationen behöver bara köpa PCR-detektionssatsen för att påbörja arbetet. Det finns många påverkande faktorer i PCR:s automatiska termiska cykel. För olika DNA-prover är mängden av olika komponenter som tillsätts i PCR-reaktionen och temperaturcykelparametrarna inkonsekventa.
Flera huvudsakliga påverkande faktorer introduceras nu enligt följande.
En, temperaturcykelparametrar
I den automatiska termiska PCR-cykeln är den mest kritiska faktorn temperaturen för denaturering och glödgning. Som visas i operationsexemplet är villkoren för denaturering, hybridisering och förlängning: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, totalt 25~30 A cykel, det amplifierade fragmentet är 500bp. Här bör tiden för varje steg beräknas efter att reaktionsblandningen når den erforderliga temperaturen. I den automatiska termocyklern tar tiden från blandningens ursprungliga temperatur till den önskade temperaturen 30-60 sekunder. Längden på denna fördröjning beror på flera faktorer, inklusive typen av reaktionsrör, väggtjocklek, reaktionsblandningens volym, värme källa (vattenbad eller värmeblock), och temperaturskillnaden mellan de två stegen, som bör tillhandahållas på lämpligt sätt när den termiska cykeln ställs in. Var uppmärksam på och beakta, och faktisk mätning bör utföras på varje instrument.
En annan viktig faktor beträffande den termiska cykeltiden är avståndet mellan de två primrarna; ju längre avståndet är, desto längre tid tar det att syntetisera målsekvensens fulla längd. Reaktionstiden som anges ovan är baserad på den optimala synteslängden på 500 bp. Målsekvensen ritas upp. Här är en introduktion till valet av olika temperaturer.
1. Templatdenatureringstemperatur Denatureringstemperaturen bestämmer temperaturen vid vilken det dubbelsträngade DNA:t smälter i PCR-reaktionen. Om denatureringstemperaturen inte uppnås kommer ingen enkelsträngad DNA-mall att produceras och PCR kommer inte att starta. Låg denatureringstemperatur betyder ofullständig denaturering, dubbelsträngat DNA. Det kommer att renatureras snabbt, vilket minskar utbytet. Generellt 90 ~ 95 ℃. När provet når denna temperatur bör det snabbt kylas till glödgningstemperaturen. DNA-denaturering tar bara några sekunder, och det är inte nödvändigt under lång tid; tvärtom bör du göra ditt bästa vid hög temperatur. Förkorta den för att bibehålla aktiviteten hos Taq DNA-polymeras. Den maximala denatureringstemperaturen efter tillsats av Taq DNA-polymeras bör inte överstiga 95°C.
2. Primerglödgningstemperatur Glödgningstemperaturen bestämmer specificiteten och utbytet av PCR; om temperaturen är hög är specificiteten stark, men om temperaturen är för hög kan primern inte kombineras ordentligt med mallen och DNA-amplifieringseffektiviteten reduceras; temperaturen är låg, utbytet är högt, men för lågt kan orsaka primer- och mallfelmatchning, Icke-specifika produkter ökar. Börja i allmänhet med reaktionsvillkoret 37 ℃, ställ in en serie kontrollreaktioner för att bestämma den optimala glödgningstemperaturen för en specifik reaktion. Det kan också antas baserat på (G+C)%-halten i primrarna för att förstå testet. Startpunkten för det allmänna testet, glödgningstemperaturen Ta (glödgningstemperatur) är 5 ℃ lägre än smälttemperaturen TTm (smälttemperatur) för amplifieringsprimern, som kan beräknas enligt formeln:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Bland dem representerar A, T, G och C respektive antalet motsvarande baser. Till exempel, för en primer med 20 baser, om innehållet av (G+C)% är 50%, kan startpunkten för Ta ställas in på 55°C. Vid en typisk primerkoncentration (som 0,2μmol/L) kan glödgningsreaktionen slutföras på några sekunder, och långtidsglödgning är inte nödvändig.
3. Valet av primerförlängningstemperatur beror på den optimala temperaturen för Taq DNA-polymeras. Vanligtvis 70–75 ℃, standardhastigheten för enzymkatalyserade nukleotider vid 72 ℃ kan nå 35–100 nukleotider/sek. varje minut. Längden på 1 kb kan förlängas, och dess hastighet beror på buffertlösningens sammansättning, pH-värde, saltkoncentration och DNA-mallens natur. Om det amplifierade fragmentet är kortare än 150 bp kan förlängningssteget utelämnas och det blir en dubbel temperaturcykel på grund av Taq DNA. Polymeraset är tillräckligt för att slutföra syntesen av korta sekvenser vid hybridiseringstemperaturen. För korta sekvensfragment mellan 100 och 300 bp är det effektivt att använda en snabb och enkel dubbeltemperaturcykel. Vid denna tidpunkt är primerförlängningstemperaturen densamma som glödgningstemperaturen. För DNA-fragment över 1 kb kan förlängningstiden kontrolleras inom 1 till 7 minuter beroende på längden på fragmentet. Samtidigt bör gelatin eller BSA-reagens tillsättas till PCR-bufferten för att hålla Taq DNA-polymeraset aktivt och stabilt under lång tid. Sex; 15%-20% glycerol hjälper till att amplifiera cirka 2,5 kb eller längre DNA-fragment.
4. Antalet cykler av konventionell PCR är i allmänhet 25 till 40 cykler. Det allmänna felet är att antalet cykler är för mycket, den ospecifika bakgrunden är allvarlig och komplexiteten ökar. Naturligtvis är antalet reaktionscykler för litet, och utbytet är lågt. Därför är det nödvändigt att säkerställa att produkten erhålls. Under antagandet om hastighet bör antalet cykler minimeras.
Efter att amplifieringen är avslutad kyls provet och förvaras vid 4°C.
2. Primer Primer Design
För att amplifiera mall-DNA måste du först designa två oligonukleotidprimrar. De så kallade primrarna är egentligen två oligonukleotidfragment som är komplementära till mål-DNA-sekvensen som ska amplifieras. Avståndet mellan de två primrarna bestämmer längden på det amplifierade fragmentet. , De 5'ändarna av de två primrarna bestämmer positionerna för de två 5'ändarna av den amplifierade produkten. Det kan ses att primrarna är nyckeln till att bestämma längden, positionen och resultaten av de PCR-amplifierade fragmenten, och primerdesignen är viktigare.
Det nödvändiga villkoret för primerdesign är att mål-DNA-sekvensen som är komplementär till primern måste vara känd. Sekvensen mellan de två primrarna är inte nödvändigtvis tydlig. De två kända sekvenserna är i allmänhet 15-20 baser, som kan syntetiseras med en DNA-syntetiserare. Motsvarande två komplementära primers, dessutom inkluderar principerna som allmänt följs vid primerdesign:
1. Primerlängden beräknas enligt statistik, och sannolikheten att en oligonukleotidsekvens på cirka 17 baser kan uppträda i det mänskliga genomet är en gång. Därför är primerlängden i allmänhet inte mindre än 16 nukleotider, och den högsta inte mer än 30 nukleotider, och den bästa längden är 20-24 nukleotider. Sådana korta oligonukleotider kommer inte att bilda en stabil hybrid vid polymerisationstemperaturen (som passerar 72°C). Ibland kan det vara vid 5' Lägg till sekvenser som inte är komplementära till mallen i slutet, såsom restriktionsenzymställen eller promotorer, för att slutföra genkloning och andra speciella behov; primer 5'ändbiotinmärkningen eller fluorescerande märkningen kan användas för olika ändamål såsom mikrobiell detektion.
Ibland fungerar inte primern'orsaken är okänd, du kan flytta positionen för att lösa det.
2. Sammansättningen av (G+C)% innehåll primers bör vara enhetlig, och försök att undvika att innehålla samma baspolymer. (G+C)%-innehållet i de två primrarna bör vara så lika som möjligt, i det kända amplifierade fragmentet (G+C) %-innehållet bör vara nära fragmentet som ska amplifieras, i allmänhet 40% till 60% är bättre.
3. Insidan av primern bör undvika bildning av uppenbara sekundära strukturer, särskilt hårnålsstrukturer. Till exempel:
4. Det bör inte finnas någon komplementering mellan de två primrarna mellan primrarna, speciellt vid 3'änden av primern. Även om det inte kan undvikas bör den komplementära basen med 3'änden inte vara större än 2 baser, annars är det lätt att bilda en"primerdimer" Eller"Primerdimer" (Primer dimer). Den så kallade primerdimeren är väsentligen ett dubbelsträngat DNA-fragment som bildas genom förlängning av en primer på den andra primersekvensen under inverkan av DNA-polymeras. , Är en vanlig biprodukt av PCR, och blir ibland till och med huvudprodukten.
Undvik dessutom homologa sekvenser mellan de två primrarna, speciellt oligonukleotidfragment med mer än 6 på varandra följande identiska baser, annars kommer de två primrarna att konkurrera med varandra om samma ställe i mallen; på liknande sätt kan primrarna och mål-DNA:t som ska amplifieras Eller andra sekvenser av prov-DNA:t inte ha homologa sekvenser på mer än 6 baser. Annars kommer primrarna att binda till andra ställen, vilket minskar specifik amplifiering och ökar icke-specifik amplifiering.
5. Primer 3'ändparande DNA-polymeras lägger till en enda nukleotid till 3'änden av primern. Därför måste parningskraven för 5-6 baser från 3'-änden av primern och mål-DNA:t vara exakta och strikta för att säkerställa effektiv PCR-amplifiering. .
Huruvida primerdesignen är rimlig kan verifieras genom datorsökning med PCRDESN-programvara och amerikansk PRIMER-mjukvara.
Artificiellt syntetiserade oligonukleotider bör företrädesvis renas genom kromatografi (kromatografi) eller PAGE för att avlägsna föroreningar såsom korta kedjor som inte har syntetiserats till full längd. Renade primers som förvaras i 25 % acetonitrillösning vid 4°C kan förhindra mikroorganismer Under normala omständigheter bör oanvända primers förvaras i kylskåp vid -20°C. Primerna kan förvaras i vätska i 6 månader och kan lagras i 1 till 2 år efter lyofilisering.
