1. Blötlägg objektglasen som har klättrats med PBS tre gånger i 3 minuter varje gång i odlingsplattan.
2. Fixera objektglasen med 4 procent paraformaldehyd i 15 minuter och blötlägg objektglasen i PBS i 3 gånger, 3 minuter varje gång.
3. Permeabilisera med 0,5 procent Triton X-100 (beredd i PBS) i 20 minuter vid rumstemperatur (för antigener uttryckta på cellmembranet utelämnas detta steg).
4. Serumblockering: doppa objektglasen i PBS 3 gånger i 3 minuter varje gång, torka PBS med absorberande papper, tillsätt normalt getserum (förutsatt att den sekundära antikroppskällan är get) på objektglasen och blockera vid rumstemperatur för 30 minuter.
5. Tillsätt primär antikropp: Absorbera den blockerande lösningen med absorberande papper, tvätta inte, tillsätt en tillräcklig mängd utspädd primär antikropp till varje objektglas och lägg den i en våt låda, inkubera vid 4 grader över natten.
6. Tillsätt fluorescerande sekundär antikropp: doppa objektglasen i PBST 3 gånger, 3 minuter varje gång, absorbera överskottsvätskan på objektglasen med absorberande papper, tillsätt den utspädda fluorescerande sekundära antikroppen droppvis, inkubera vid 20-37 grad i 1 timme i en våt låda, blötlägg i PBST Slice 3 gånger, 3 min varje gång.
Obs: Från tillsats av fluorescerande sekundär antikropp bör alla efterföljande steg utföras på en mörk plats så mycket som möjligt.
7. Serumblockering: torka av vätskan med absorberande papper, släpp normalt getserum på objektglaset (förutsatt att den sekundära antikroppskällan är get) och blockera vid rumstemperatur i 30 minuter.
8. Tillsätt primär antikropp: Absorbera den blockerande lösningen med absorberande papper, tvätta inte, tillsätt sedan den utspädda primära antikroppen droppvis och inkubera över natten i en 4 graders fuktig låda i mörker efter tillsats av den primära antikroppen. (Obs: arten av den andra primära antikroppen skiljer sig från arten av den första primära antikroppen, såsom mus och kanin)
9. Tillsätt fluorescerande sekundär antikropp: doppa objektglasen i PBST 3 gånger, 3 minuter varje gång, absorbera överskottsvätskan på objektglasen med absorberande papper, tillsätt den utspädda fluorescerande sekundära antikroppen droppvis, inkubera vid 20-37 grad i 1 timme i en våt låda, blötlägg i PBST Slice 3 gånger, 3 min varje gång. (Obs: Om den röda fluorescensen väljs för detektion av den första antikroppen, måste den andra välja andra fluorescensfärger)
10. Motfärgande kärnor: DAPI tillsattes droppvis och inkuberades i mörker i 5 minuter, proverna färgades och överskottet DAPI tvättades bort med PBST 5 min×4 gånger.
11. Torka vätskan på objektglaset med absorberande papper, förslut objektglaset med en monteringsvätska som innehåller antifluorescenssläckare och observera och samla in bilder under ett fluorescensmikroskop.
